旋毛虫病的几种诊断方法及比较
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旋毛虫病是一种严重的人畜共患疾病，是英国人Peacock于1828年首次在人体中发现并由Owen（1835）命名为旋毛线形虫。我国于1965年在西藏地区发现首例人体旋毛虫病。旋毛虫病研究的重点在于诊断方法。 旋毛虫病的诊断主要分为病原学诊断方法和免疫学诊断方法。病原学诊断主要都是采用活检方式，漏检率较高，并且会造成创伤，效果不好。而免疫学诊断灵敏度高，已经广泛被利用于人体旋毛虫病血清流行病学的调查。本文主要介绍间接荧光抗体试验（1FAT）、免疫酶染色试验（1EST）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等免疫学诊断方法。 1 诊断方法 1.1 间接荧光抗体试验（IFAT） 1.1.1 感染肌肉组织抗原片的制备 取感染旋毛虫病猪的膈肌作材料，经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，切片厚度5～10微米，明胶-钾明矾溶液作粘片粘附剂。每张载玻片排放2～4块切片。烘干后常规脱蜡，用0.01摩尔pH7.4PBS洗3次后切片，分别经过氧化氢-甲醇溶液及1∶20倍稀释的正常兔血清37℃各处理20分钟，如上用PBS洗后用滤纸条吸干水分或自然干燥即为诊断用抗原片，置4℃冰箱保存备用。 1.1.2 荧光抗体的制备 1.1.2.1 兔抗猪IgG的制备 健康猪血清经饱和硫酸铵盐析，Sephadex～G25脱盐后用DEAE纤维素纯化。用纯化后的猪IgG免疫家兔制得兔抗猪血清后，再按提纯猪IgG的方法提纯兔抗猪IgG。 1.1.2.2 抗体的标记 精取异硫氰酸荧光素（FITC）3毫克，加入0.5摩尔/升碳酸钠溶液0.3毫升，使FITC充分溶解。取10毫克/毫升的兔抗猪IgG6毫升，在室温下逐滴加入FITC溶液，边加边搅拌，加完后，室温下继续搅拌3小时。 1.1.2.3 荧光抗体的纯化及质量鉴定 将标记后的荧光抗体溶液在4℃下用0.01摩尔pH7.4PBS透析4～5天，直到再无荧光色素透出为止。经过透析的荧光抗体再经Sephadex－G25层析。用紫外分光光度计分别测495纳米及280纳米处的密度值后算得标记的荧光抗体F/P值为2。 1.1.3 测试方法及结果判定 抗原片滴加含20%正常兔血清及1%牛血清白蛋白的PBS，37℃孵育20分钟；用PBS冲洗后滴加用含5%正常兔血清的PBS作1∶100稀释的待检血清，37℃孵育45分钟；PBS冲洗后再滴加1∶10倍稀释的荧光抗体溶液，37℃孵育45分钟。PBS冲洗后滴加无荧光甘油缓冲液置荧光显微镜下检查，以切片中肌幼虫切面出现黄绿色荧光者判为阳性。 每批试验应设阳性、阴性参考血清对照和猪正常肌组织切片对照。 1.2 免疫酶染色试验（IEST） 1.2.1 待检血清 实验室感染8周旋毛虫豚鼠血清35份。 1.2.2 抗原的制备 剖杀经人工感染旋毛虫幼虫2个月的大白鼠，取膈肠肌及后腿内侧肌肉，镜下压片每个视野平均7条幼虫，用磷酸缓冲液冲洗后，用冰冻切片机切成6微米厚的幼虫冰冻切片，每张载玻片裱贴5块组织片，经丙酮固定后；即为IEST抗原片，保存-20℃备用。 1.2.3 操作步骤 在旋毛虫幼虫冰冻切片上，将测试血清用0.01摩尔/升pH7.4～7.6PBS（含0.05%吐温～20）稀释成5，10，20，40，80，160比例的浓度（起始浓度为血清原液），分别滴于切片上，每次试验设阴性血清对照。置湿盒中，35℃孵育60分钟，用0.01摩尔/升pH7.4～7.6PBS洗涤3次，每次5分钟，吹干，滴加酶标葡萄球菌蛋白A（HRP～SPA），同上孵育洗涤，滴加底物溶液（3′3-二氨基联苯胺四盐酸盐-过氧化氢），室温反应15～20分钟，弃底物，用蒸馏水速洗，趁湿片在普通光学镜下观察反应结果。 1.2.4 结果判断 根据感染大鼠肌肉切片上的幼虫切面显色的深浅，记录结果。反应不着色（-），反应呈现淡棕色（＋）、棕色（＋＋）、棕褐色（＋＋＋）。若待检血清lEST滴度≥1∶10（＋）时，即为lEST阳性。 1.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫吸附试验按非均相测定法可分为10种类型，但常用的有4种：直接型、间接型、双抗体夹心型、固相抗体竞争型。本文主要介绍间接型（常规ELISA试剂盒法）。 1.3.1 试剂盒准备 根据情况选用合适的ELISA试剂盒。 1.3.2 检样的准备 在受检猪耳静脉采血2滴，滴于1厘米×2厘米的滤纸片上，将其浸泡于0.01摩尔/升pH7.4PBS（含0.05%吐温-20）2毫升，37℃2小时或4℃过夜，备用。阴阳性血清作1∶200稀释，被检血清作1∶100稀释。 1.3.3 操作方法与结果判断 1.3.3.1 加样 于诊断盒每孔加检样100微升，室温（25℃）静置2分钟。 1.3.3.2 反应 甩去被检液，每孔加1号试液1滴（40微升），室温静置2分钟。 1.3.3.3 洗涤 甩去1号试液，每孔加2号试液1滴（40微升），立即用蒸馏水或自来水反复冲洗5次以上。 1.3.3.4 显色 拍干反应板上的残液，每孔先加3号试液1滴，再加4号试液1滴，轻轻混匀，室温静置2～3分钟。 1.3.3.5 判定 在白色背景下，兰色为阳性，吸收度≥0.3，无色为阴性，吸收度≤0.1。 2 比较 间接荧光抗体试验（IFAT）、免疫酶染色试验（IEST）、酶联免疫吸附试验（ELISA）是旋毛虫病当前诊断常用的免疫学方法。 间接荧光抗体试验（IFAT）较早用于诊断旋毛虫病，优点是制备的荧光标记抗体，可以用于多种抗原、抗体系统的检测。初期用全虫作抗原，用试管法检测后发展为用虫体或带虫肌肉切片作抗原。崔晶等应用旋毛虫幼虫冰冻切片抗原，以IFAT检测216份旋毛虫病人血清，抗体阳性率为90.74%，发病后第1周抗体阳性率70.59%，第2周升至91.30%，有显著差异（P＜0.025），至第3、4周分别达95.83%和100%。旋毛虫幼虫抗原片在-20℃至少可保存2.5年而不失活。 免疫酶染色试验（IEST）与ELISA的原理基本相似。陈雅棠等用人工感染旋毛虫大鼠肌肉的冰冻切片作为抗原，用1EST检测待检血清，在11例肌肉活检证实有旋毛虫感染的病人中，阳性率为81.8%，与正常对照组和其它寄生虫感染有明显差别。试验者认为其特异性和灵敏性不低于ELISA。张玉光等用人工感染3个月以上大鼠的膈肌及腿内侧肌制成冰冻切片作为抗原，用IEST和皮内试验对比检测1412名中学生，IEST阳性率为11.4%，皮试阳性率为16.93%。 酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前公认的检测旋毛虫特异抗体的较好的方法，有极高的敏感性和特异性。国外已将检查旋毛虫的ELISA方法作为猪只屠宰前的常规检查。我国经过长期实践，实验技术也得到了不断地改进，已从常规的ELISA发展为SPA-ELISA、DOT-ELISA等，旋毛虫ELISA诊断试剂盒也研究成功并推广试用。现今ELISA已广泛应用于旋毛虫病的流行病学调查和临床诊断。但是ELISA也有缺陷：其操作相对较繁琐且要求的实验条件也较高，基层应用尚有一定困难。
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