副猪嗜血杆菌lpxM基因缺失株构建及生物学特性分析
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研究副猪嗜血杆菌脂寡糖合成相关基因lpxM对其生长、生物被膜形成能力、抗50%猪血清杀菌能力、对巨噬细胞毒力和抗生素敏感性部分生物特性的影响,为揭示HPS致病机制,lpxM基因缺失疫苗的构建奠定理论基础,为猪场防治HPS进行药物选择时提供依据。 以高致病性血清5型HPS地方分离株H45为研究对象,自杀性质粒PK18mobsacB为载体,通过自然转化法将构建好的重组质粒转进H45,使其在抗生素的压力下发生同源重组,最终经过抗生素筛选并通过PCR和测序验证得到lpxM基因缺失株H45-△lpxM,比较两者之间部分生物学特性的差异。测定两者的OD600-t关系曲线比较生长情况;用结晶紫染色法比较两者在培养24h后生物被膜形成的能力;测定两者在50%猪血清中存活率,比较两者的抗血清补体杀菌能力;将两者同时刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞,作用时间为6、12和24h,检测细胞培养上清液中LDH的释放量,比较两者对巨噬细胞毒力影响;利用K-B 纸片扩散法研究两者对氨苄西林等临床上常用13种抗生素和多粘菌素B抗生素敏感性,通过测定抑菌圈直径来并参照耐药标准判断对抗生素的敏感性。 成功构建lpxM基因缺失株H45-△lpxM,生长情况比较发现菌株生长前期缺失株慢于野生株,8h后保持一致,结果表明lpxM基因缺失能在一定程度上抑制H45的生长;两者均能形成生物被膜,但是缺失株弱于野生株;野生菌株在50%猪血清中存活率为16.1%,而缺失株只有0.71%,缺失株明显低于野生菌株;两者均能引起巨噬细胞的死亡,作用6、12和24h后,野生株对细胞的致死率分别为6.63%、10.86%和22.17%,而缺失株对细胞的致死率为2.62%、6.35%和18.01%,结果表明随着作用时间的延长,两者对细胞的毒力作用越来越大,具有一定的时间依赖性,在各个时间点,缺失株的毒力作用均低于野生株;抗生素敏感性结果发现,两者对头孢噻吩等10种抗生素均表现敏感,对恩诺沙星均表现抗性,但对阿莫西林克拉维酸、磺胺二甲异噁唑和氨苄西林三种抗生素的耐药性发生了较大的差异,阿莫西林克拉维酸和磺胺二甲异噁唑两种抗生素由耐药变成了敏感,氨苄西林也从中介变成敏感,结果表明lpxM基因缺失对H45抗生素敏感性具有一定影响。 lpxM基因缺失能一定程度地抑制HPS生长,降低其生物被膜形成能力、抗血清杀菌能力和对巨噬细胞的毒力作用,增大对临床上多数常用抗生素的敏感性,揭示lpxM基因可能是HPS毒力基因,与HPS的致病能力密切有关,但具体机制还需要进一步研究。
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